Det vides ikke præcist, hvor længe Margarethenhof har eksisteret. På et billede af byen, der blev anlagt mellem 1572 og 1618, kan man dog allerede se en afsidesliggende gård nær Jürgensby ved bredden af Flensborg Fjord, som mistænkes for at være forløberen for nutidens gård. Gården har været attesteret siden 1609, hvor gården var ejet af Lange-familien. I den følgende periode skiftede gården ofte hænder.

I det 18. århundrede blev gården omdannet til et virksomhedssted, da Peter Holst erhvervede gården i 1759 og begyndte at drive en sæbefabrik der. Fra 1762 var gården hjemsted for en sukkerfabrik, hvorfor gården blev kaldt Zuckerhof. Råsukker blev importeret fra Dansk Vestindien og forarbejdet til sukker, stenslik og sirup. I 1844 erhvervede købmand Nikolaus Jepsen gården og opkaldte den efter sin svigermor Margarethe Rottmann (* 1780; † 1846), da depositummet for købet af gården var blevet stillet til rådighed af hendes mand, købmanden, skibsrederen og den russiske vicekonsul Friedrich Wilhelm Funke. På gården, der nu hedder Margarethenhof, blev der oprettet et jernstøberi under Nikolaus Jepsen.


Tilsmudset jord foran gården fungerede også som byggeplads for støberiet. I 1882 blev gården omdannet til fabriksejervilla af den preussiske arkitekt Richard Plüddemann, der også tegnede Flensborgs gård. I 1896 fremstillede ovennævnte jernstøberi blandt andet fyrtårnene Rinkenis, Laagmai og Schottsbüll, som blev opført på nordsiden af Flensborg Fjord.
Under Anden Verdenskrig blev det nordlige pakhus, der stammer fra 1761, ramt og ødelagt under et bombeangreb på Flensborg.


Ved årtusindskiftet begyndte en omfattende renovering af Margarethenhof, efter at den var blevet solgt til et bydende konsortium med betingelse om renovering.
Mellem 1995 og 2003 blev den nydesignede forplads foran Margarethenhof bygget med sine bygninger.
